Intrageniczna delecja genu KALIG-1 w zespole Kallmanna czesc 4

Schemat końca 3 genu KALIG-1 i regionu genomowego zaangażowanego w delecję w zespole Kallmanna związanym przez X. Rozmiary eksonów (otwarte prostokąty) i introny (linie ciągłe) uzyskano za pomocą mapowania sekwencyjnego i restrykcyjnego. Wyświetlane jest położenie kodonu stop na końcu otwartej ramki odczytu KALIG-1. Granice 5 i 3 usuniętego regionu są oznaczone poprzecznymi kreskami. Pozycje dwóch starterów oligonukleotydowych (T312A i 5771 BP) stosowanych w amplifikacji PCR DNA pacjenta wskazano na górze. Sekwencje punktów przerwania delecji 5 i 3 w prawidłowym DNA pokazano pod każdą pozycją. Nukleotydy zachowane w DNA pacjentów i 2 są podkreślone. Chromatogram sekwencji fragmentu połączenia w DNA pacjenta pokazano na dole. Rozbudowana analiza mapowania restrykcyjnego regionu końcowego 3 genu KALIG-1 w DNA od zdrowych osób i dwóch pacjentów pozwoliła nam przewidzieć przybliżone położenie punktów przerwania delecji. Jeden punkt przerwania został przypisany do przedostatniego intronu, a drugi do ostatniego eksonu. Startery oligonukleotydowe zostały zaprojektowane z sekwencji tych dwóch regionów. Do ostatniego eksonu użyliśmy poprzednio opublikowanej sekwencji.22 Przeprowadzono dalszą analizę sekwencji w celu zaprojektowania starterów dla przedostatniego intronu. Te primery (T312A i 5771BP) zastosowano do amplifikacji regionu delecji w rodzinie pacjentów metodą PCR. Te dwa startery są w przybliżeniu 4 kb od siebie w genie KALIG-1 (ryc. 2), a zatem amplifikacja normalnego genomowego DNA byłaby bardzo trudna. Jak pokazano na Fig. 1B, obecne było silne pasmo amplifikacji o wielkości około 800 bp, gdy stosowano DNA zarówno od Pacjenta 1, jak i jego matki, ale nie w przypadku użycia DNA od babki pacjenta, jego ciotki lub normalnego osobnika. Słabe prążki 4-kb, odpowiadające wielkości oczekiwanego produktu w normalnym DNA, znaleziono, gdy zastosowano DNA z klonu drożdżowego ze sztucznym chromosomem obejmującym region (YAC X2, opisany przez Franco i wsp.22). Wyniki te wskazują, że ani babka pacjenta, ani jego ciotka nie usunęły genu; wyraźnie wskazują również, że produkt amplifikacji DNA o 800 pz od pacjenta i jego matki obejmuje punkty przerwania delecji. Produkt PCR o 800 bp subklonowano i zsekwencjonowano. Figura 2 pokazuje mapę 3 regionu końcowego genu KALIG-1 i regionu usuniętego u dwóch pacjentów, wraz z sekwencjami regionów punktu przerwania w prawidłowym DNA i węzłem delecyjnym u pacjentów. Interesujące jest to, że w punkcie przerwania delecji wykryto homologię o wartości 6 pz (CAAATT). Ten krótki odcinek homologii sekwencji może być zaangażowany w mechanizm molekularny leżący u podstaw zdarzenia powodującego delecję, jak wcześniej sugerowano w innych przypadkach delecji28. 29 Warto również zauważyć, że delecja obejmuje przedostatni ekson kodujący jeden z wcześniejszych scharakteryzował domeny genu KALIG-1, który jest homologiczny z cząsteczkami zaangażowanymi w adhezję komórek nerwowych (domena C22).
Dyskusja
Badania pacjentów z zespołem Kallmanna, którzy mieli duże rearanżacje odległego krótkiego ramienia chromosomu X (Xp22.3) doprowadziły do zdefiniowania krytycznego regionu obejmującego około 70 kb, który musi zawierać co najmniej część genu dla tego zespołu. 22, 23 Wyizolowaliśmy gen, KALIG-1, którego koniec 3 leży w tym krytycznym regionie.22, 23 Produkt białkowy przewidywany z sekwencji genowej KALIG-1 dzielił domeny homologiczne z białkami zaangażowanymi w migrację neuronów, co sugeruje związek pomiędzy KALIG-1 i wadliwa migracja neuronów obserwowana u pacjenta z zespołem Kallmanna19. Jednak nadal potrzebny był formalny dowód na bezpośredni związek między delecjami genu KALIG-1 a zespołem.
[podobne: art dental, maseczka z siemienia lnianego na włosy, olej z gorczycy ]