Mutacje bzdur w genie BCS1L jako przyczyna zespołu Björnstad ad

Kompleks III jest następnie łączony z kompleksami IV i I w superkomplet respirasome, który ułatwia transfer elektronów wymagany do syntezy ATP. Mutacje BCS1L były wcześniej zgłaszane jako powodujące kompleksowy niedobór III1 (objawiający się przez tubulopatię u noworodków, encefalopatię i niewydolność wątroby, Online Mendelian Inheritance in Man [OMIM] o numerze 606104) i bardziej poważne zaburzenia wewnątrzmacicznego opóźnienia wzrostu, aminoaciduria, cholestaza, nadmierne obciążenie żelazem , kwasica mleczanowa i przedwczesna śmierć, określane jako zespół GRACILE (numer OMIM 603358) .11,12 Wyniki kliniczne tych głęboko ciężkich zaburzeń wielonarządowych są bardziej typowe dla mutacji genowych, które zaburzają mitochondrialny kompleks łańcucha oddechowego, niż bardzo ograniczony kliniczny odkrycia związane z zespołem Björnstad.
Aby zrozumieć, w jaki sposób mutacje BCS1L powodują tak różne fenotypy kliniczne, rozważaliśmy lokalizacje defektów na strukturze białka BCS1L i porównano funkcję zmutowanego BCS1L w drożdżach i ludzkich limfocytach. Badania te wykazały, że mutacje BCS1L zmieniły skład mitochondrialnego respirasomu, zmniejszyły aktywność łańcucha transportu elektronów i zwiększyły produkcję reaktywnych form tlenu. Produkcja reaktywnych form tlenu była skorelowana z ciężkością kliniczną różnych mutacji BCS1L. Dane te wskazują, że poza mitochondrialną heteroplazmą i zmiennymi wymaganiami energetycznymi tkanek wrażliwość tkanek na reaktywne formy tlenu przyczynia się do zmienności przejawów defektów mitochondrialnych.
Metody
Sekwencjonowanie DNA i analiza mutacji
Zamplifikowano genomowy DNA, przygotowany jak opisano wcześniej, przy użyciu starterów flankujących granice genów egzon-intron, i zsekwencjonowaliśmy DNA za pomocą metody ABI BigDye w analizatorze DNA Applied Biosystems Prism 3700. Warianty sekwencji potwierdzono przez trawienie enzymem restrykcyjnym, a polimorfizmy zidentyfikowano w bazach danych Narodowego Instytutu Zdrowia (NIH) 13 i Celera14.
Immunohistochemia
Zatopione w parafinie skrawki ludzkiej tkanki głowy i mysich tkanek ucha wewnętrznego przygotowano do odzyskiwania antygenu, jak opisano wcześniej. Skrawki skóry głowy poddano reakcji z przeciwciałami przeciwko BCS1L (Proteinech Group) i białkiem rdzeniowym (Molecular Probes), po czym wykrywano antygen za pomocą sprzężony z fluoresceiną układ biotyna-streptawidyna (Vector Laboratories). Wiązanie przeciwciała z mysimi sekcjami ucha wewnętrznego wykryto za pomocą fosfatazy alkalicznej i substratu NBT / BCIP (Roche). Obrazy fluorescencyjne rejestrowano za pomocą mikroskopu konfokalnego (Leica Microsystems) i przetwarzano za pomocą oprogramowania NIH Image i Adobe Photoshop.
Badania uzupełniające z drożdżami
Mutacje wprowadzono do ludzkiego BCS1L za pomocą zestawu do ukierunkowanej mutagenezy (QuikChange, Stratagene), który wykorzystywał zachodzące na siebie startery zawierające pożądaną mutację, które wprowadzono do wektora pMGL3.16 Konstrukty transfekowano do drożdży pozbawionych Bcs1 (aW303.Bcs1) i hodowano na bogate (YPDekstroza) lub selektywne wobec mitochondriów (YPEthanol / Glicerol) pożywki w 30 ° C przez 4 dni. Wielkość i wzrost kolonii (mierzonej razy podwojenia fazy logarytmicznej hodowli, stężenie początkowe, x 105 komórek na studzienkę) porównano dla drożdży typu dzikiego (W303-1A) i aW303.Bcs1 transfekowanych drożdżami typu dzikiego Bcs1, ludzki BCS1L typu dzikiego, pusty wektor (pMGL3) lub ludzki mutant BCS1L.
Ekstrakcja, analiza i zawartość mitochondriów
Aktywnie rosnące transformowane limfocyty przepłukano i surową frakcję mitochondrialną ekstrahowano jak opisano uprzednio.17 Preparaty mitochondrialne, wyizolowane w obecności lub nieobecności magnezu plus ATP lub .S-ATP, solubilizowano w 0,75 M kwas .-aminokapronowy, 50 mM Bis-Tris (pH 7,0) i 5 mg digitoniny na mililitr (wszystkie z Sigma)
[przypisy: teosyal, dabrafenib, bimatoprost ]
[podobne: przeciski pod drogami, dabrafenib, Leukocyturia ]
[podobne: usg kolana kraków, jak rozróżnić kota od kotki, vigantoletten 1000 ulotka ]